Биохимические методы исследования гормонов

Методы биохимических исследований

В биохимии широко применяют диализ, центрифугирование, оптические методы, различные виды хроматографии и др.

В основу абсорбционной спектроскопии положен принцип измерения поглощения света, проходящего сквозь раствор исследуемого вещества, вследствие его абсорбции. Измерение спектров осуществляют на специальных спектральных аппаратах, в которых пробу вещества помещают между источником света и фотоэлементом, регистрирующим свет. Каждое вещество имеет характерный свет поглощения. Для аналитических целей используют длину волны, соответствующую максимуму поглощения исследуемого соединения (λmax).

Фотоэлектроколориметрия – это измерение поглощения видимой части спектра окрашенными растворами.

Собственно спектрофотомерия – это измерение поглощения (пропускания) прозрачных растворов в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной зонах спектра (220-1100 нм).

Нефелометрия – метод измерения интенсивности рассеянного света.

К приборы, базирующимся на измерении светопоглощения веществ, относятся фотоэлектроколориметры (ФЭК) и спектрофотометры (СФ). ФЭК позволяют проводить измерения поглощения в видимой части спектра. СФ дают возможность проводить измерения в широком диапазоне длин волн – от ультрафиолетового до инфракрасного (210-1100 нм) и исследовать окрашенные и бесцветные растворы в узкой зоне спектра, на участке максимального поглощения монохроматического потока света.

В основе абсорбционной спектрофотометрии лежат общие принципы способности веществ поглощать световую энергию по законом Бугера-Ламберта и Бера: D = k c d;

где D – оптическая плотность раствора;

k – молярный коэффициент поглощения (экстинкция), который равен оптической плотности 1 М раствора при толщине слоя в 10 мм;

с – концентрация раствора, моль/л;

d – толщина слоя жидкости, см.

Явление электрофореза – это перемещение заряженных частиц в электрическом поле.

Поведение частицы в электрическом поле описывается тремя основными характеристиками: скоростью движения частицы v, электрокинетическим потенциалом  и электрофоретической подвижностью U. -потенциал прямо пропорционален свободному (не скомпенсированному ионами среды) заряду частицы (Q) и обратно пропорционален ее радиусу (r). Скорость заряженной частицы прямо пропорциональна -потенциалу. Электрофоретическая подвижность U равна отношению скорости частицы к напряжению электрического поля.

где Е – напряженность электрического поля, В/см;

– диэлектрическая постоянная среды,

Наиболее часто метод используют для аналитических целей – для разделения смеси заряженных веществ на фракции с последующим качественным и количественным их определением. Таким способом удается разделить, например, белки сыворотки крови на 5 фракций: альбумин и 4 фракции глобулинов. Эту задачу часто решают в клинической биохимии, так как соотношение фракций закономерно изменяется при многих патологических процессах.

Метод подразделяется на фронтальный или свободный электрофорез (электрофорез в жидкой среде) и зональный или электрофорез в поддерживающих средах. В качестве поддерживающих сред применяются различные инертные пористые природные либо синтетические материалы: бумага, ацетилцеллюлоза, крахмал в виде влажных зерен и в виде геля, гель агара либо агарозы, полиакриламидный синтетический гель – ПААГ. Задача поддерживающей среды – стабилизировать жидкость, уменьшить диффузию, а в ряде случаев – создать дополнительный механизм разделения. Например, в некоторых вариантах метода разделение по электрофоретической подвижности можно сочетать с разделением по молекулярной массе (наилучшим образом это достигается в ПААГ).

Одной из высокоразрешающих разновидностей метода является диск-электрофорез (от английского «discontinuos» — прерывистый, неоднородный). В этом методе движение молекул проходит вначале через концентрирующий крупнопористый гель, где разделяемая смесь концентрируется благодаря движению между 2-мя сортами ионов. Движущиеся впереди пробы ведущие ионы (принадлежат сильному электролиту) и находящиеся позади пробы замыкающие ионы (принадлежат слабому электролиту) создают разную напряженность поля по обе стороны зоны, занятой пробой. Вследствие этого «фронт» пробы тормозится, а «тыл», напротив, подгоняется. Таким путем достигается эффект концентрирования. Затем проба переходит в разделяющий гель с иным значением рН буферного раствора. Вследствие изменения рН (а значит, и степени диссоциации слабого электролита) замыкающие ионы опережают пробу, которая перемещается теперь на фоне замыкающих ионов — оказывается в однородной по рН мелкопористой среде. В этом втором, разделяющем геле происходит обычный электрофорез. Повышение разрешающей способности метода достигается за счет того, что перед разделением проба концентрируются в виде очень узкой стартовой зоны, и таким образом удается разделить даже вещества, мало отличающиеся друг от друга по свойствам.

Хроматографические методы основаны на динамическом раз­делении смеси веществ. Общий принцип хроматографии состоит в том, что непрерывный поток подвижной фазы, содержащей анализируемый образец, направленно проходит через стационарную фазу, которая в зависимости от своей природы, взаимодействует в различной степени с компонентами образца.

Распределение соединения между двумя несмешивающимися фазами определяется коэффициентом распределения, который для каждого конкретного вещества в системе из двух фаз при данной температуре постоянен и выражается отношением концентрации вещества в подвижной фазе к его концентрации в стационарной фазе. Фазы для хроматографического разделения выбирают так, чтобы коэффициенты распределения компонентов смеси в них были различными.

В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы хроматографические методы делят на газовую и жидкостную хроматографию; в зависимости от геометрической формы стационарной фазы – на колоночную и плоскостную (бумажную или тонкослойную).

В зависимости от механизма разделения веществ выделяют следующие виды хроматографии:

Адсорбционная хроматография основана на различной адсорбируемости компонентов разделяемой смеси на поверхности раздела фаз. Эти различия связаны главным образом с различиями в дипольных моментах (в полярности) разделяемых веществ, а также подвижной и неподвижной фаз хроматографической системы. Так, из полярной подвижной фазы на неполярном адсорбенте лучше адсорбируются неполярные вещества. Примером неполярного адсорбента может служить активированный уголь, сажа; полярного – окислы металлов, гидроокиси, некоторые соли, силикагель, полисахариды.

Абсорбционная или распределительная хроматография основана на различной абсорбируемости (поглощении всем объемом стационарной жидкой фазы, растворимости в ней) компонентов разделяемой смеси. В основе метода также лежит соотношение дипольных моментов разделяемых веществ и компонентов хроматографической системы. Примером распределительной хроматографии может служить разделение аминокислот в системе бутанол-вода либо фенол-вода. Стационарная полярная фаза – вода — удерживается инертным пористым твердым телом – бумагой, силикагелем и т.п.. Бутанол – неполярная подвижная фаза содержит компоненты разделяемой смеси и движется относительно воды, удерживаемой твердой пористой подложкой.

Хемосорбционные методы основаны на использовании хемосорбции. Наиболее распространенным из них является ионообменный метод, в котором используются различия в константах диссоциации разделяемых веществ-электролитов. Разделяемые вещества в виде катионов или анионов обратимо обмениваются на катионы или анионы, содержащиеся в стационарной твердой фазе (катионите или анионите, соответственно). Подвижная фаза – полярный растворитель (обычно буферный или солевой водный раствор). В качестве твердого пористого тела, содержащего прикрепленные к нему обмениваемые ионы, служат природные или синтетические полимеры – ионообменные смолы (целлюлоза, декстран, агароза, полиакриламид, полистирол).

Гель-хроматография или молекулярно-ситовая хроматография основана на разделении веществ в соответствии с их размерами (молекулярными массами). В этом методе используются те же пористые тела, что служат основой для ионообменной хроматографии, но без прикрепленных к ним ионогенных групп. Материал стационарной фазы представляет собой сферические гранулы определенного размера, внутри которых имеются поры. Размер пор также стандартен и выбирается так, чтобы обеспечить хорошую разрешающую способность метода. Наиболее крупные молекулы не могут проникнуть во внутренние мелкие поры и передвигаются только по промежуткам между гранулами. Они идут с наибольшей скоростью. Более мелкие частицы движутся с разными скоростями, в зависимости от того, какая доля объема внутренних пор доступна для них в соответствии с их размерами. Медленнее всех движутся самые мелкие молекулы.

Аффинная хроматография. Метод основан на специфическом сродстве (affinity) некоторых биологически активных веществ друг к другу. Один из партнеров – аффинант – обездвиживают (иммобилизуют) на твёрдой пористой подложке, вместе с которой он образует стационарную фазу. Второй партнер содержится в подвижной фазе. Аффинная хроматография позволяет выделить его из смеси любой степени сложности. Так, при пропускании через крахмал был выделен из панкреатического сока только один из его компонентов – фермент амилаза, для которого крахмал является субстратом. Наиболее распространенные пары веществ: фермент и субстрат, фермент и ингибитор, фермент и кофермент, антитело и антиген, рецептор и сигнальная молекула, транспортный белок и транспортируемое им вещество, комплементарные друг другу нуклеотиды. В связи с чем аффинная хроматография широко используется для очистки антигенов и антител, гормонов, рецепторов, транспортных белков, ферментов и т.п.

Разделение и исследование веществ с помощью центрифугирования основано на разной скорости оседания (седиментации) в центробежном поле частиц, имеющих разную плотность, форму или размеры.

Коэффициент седиментации зависит от молекулярной массы и формы частицы, а также от плотности и вязкости среды выделения, что используется для определения молекулярной массы.

Простейшая задача центрифугирования заключается в отделении осаждённых веществ от растворов как этап выполнения аналитических работ. Например, отделение белков от других органических соединений после осаждения. Подбирая скорости центрифугирования и определенные среды выделения, можно избирательно осаждать разные клеточные структуры: ядра, митохондрии, лизосомы, рибосомы, эндоплазматический ретикулум.

Основаны на способности нестабильных радиоизотопов испускать частицы или электромагнитное излучение, которые фиксируются специальными методами.

Основными преимуществами методов с применением радиоизотопных меток являются их чувствительность и возможность вводить метки в живой организм, что позволяет исследовать метаболические превращения, механизмы и скорости поглощения и переноса веществ в интактном организме, возраст биологических образцов.

источник

Биохимические методы исследования гормонов

За последние несколько лет в результате разработки более тонких, чувствительных и специфических методов определения гормонов клиническая эндокринология во многом превратилась из своего рода искусства в раздел прикладной биохимии, физиологии и фар­макологии. Этот прогресс оказался возможным благодаря выделе­нию и последующей биологической и биохимической характерис­тике различных высокоочищенных полипептидных гормонов, стероидов, витаминов, производных небольших полипептидов и аминокислот, которые относят к гормонам, а также получению меченных радиоактивными атомами гормонов с высокой удельной активностью. Многие эндокринные заболевания распознаются или по крайней мере предполагаются на основании присутствия слиш­ком большого или слишком малого количества нормально секре­тируемого гормона. Возможность определения низкого уровня гор­монов в биологических жидкостях оказала существенную помощь в упрощении диагностических исследований.

Для количественного определения гормонов в тканях и жидких средах организма вначале применялись относительно грубые и громоздкие биологические методы. С разработкой более чувстви­тельных радиоиммунологических и радиорецепторных методик появилась возможность использовать более быстрые и экономич­ные способы определения гормонов, которые по существу стали краеугольным камнем клинической эндокринологии. Несмотря на свои недостатки, классические биологические методы сохранили значение для полной характеристики гормона, особенно в услови­ях возможного расхождения его биологических и иммунологиче­ских свойств. К счастью, уровень гормонов, определяемый радио­иммунологическим и биологическим методами коррелируют друг с другом. В связи с этим концентрация гормонов, определяемая с по­мощью радиоиммунологического метода, обычно свидетельствует об уровне биологически активных гормонов в крови. Эта связь достаточно случайна, поскольку биологическая и иммунологиче­ская активность, как правило, отражает разные свойства, и прису­ща она разным участкам молекулы гормона.

Получение высокоочищенных гормональных препаратов не про­сто дало возможность разработать чувствительные методы измере­ния концентрации гормонов, но и снабдило исследователей неоце­нимым средством углубленного проникновения в механизмы их клеточного действия. С помощью этих средств выяснилось, что клинические расстройства могут обусловливаться нарушением не только секреции, но и действия гормонов в силу качественных или количественных изменений рецепторов отдельных гормонов, равно как и внутриклеточных биохимических механизмов опосредования гормонального эффекта. В настоящей главе описаны общие прин­ципы надежности методов биологического, радиоиммунологическо­го и радиорецепторного определения гормонов и общие требова­ния, предъявляемые к этим методам. В большинстве случаев ис­следования весьма сложны, требуют тонкой аппаратуры и опыта экспериментатора. Кроме того, проведение таких исследований требует времени, причем разного при определении разных гормо­нов, так что получение «моментальных» результатов редко воз­можно. Ничто не может привести заведующего лабораторией в большее уныние, чем требование определить уровень паратгормо­на в сыворотке за 10 мин после отправки пробы в лабораторию. Время, необходимое для проведения анализа, варьирует от не­скольких часов до нескольких дней в зависимости от метода опре­деления и определяемого гормона.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Результаты анализа гормонов, выполняемого в различных лабора­ториях, должны выражаться в общепринятых стандартных едини­цах. Результаты биологических исследований приводятся обычно в системе единиц международного стандарта, полу­чаемого из ВОЗ. Эти результаты могут быть выражены и в едини­цах препарата сравнения, получаемого лабораториями из центров, обслуживающих более ограниченные географические области. В таком случае результаты анализа следует сопровождать указанием на способ пересчета единиц препаратов сравнения в единицы международных стандартов. Хотя полипептидные гормо­ны и являются высокоочищенными, но в соответствующих препа­ратах присутствуют небольшие, но влияющие на результаты ана­лиза примеси; поэтому обычно избегают приводить результаты биологических и иных определений в единицах массы гормона. Количество большинства полипептидных гормонов, определяемое с помощью биологических или радиоиммунологических методов, оценивают в системе единиц, ранее установленных ВОЗ. С другой стороны, поскольку стероидные и тиреоидные гормоны существуют в химически чистом виде, результаты их определения обычно вы­ражают в единицах массы. Поскольку в разных лабораториях используют несколько (хотя и существенно) различающиеся реак­тивы и методики, каждая лаборатория должна определять пределы нормальных колебаний концентрации гормонов в пробах, отбирае­мых в стандартных условиях и анализируемых с помощью тща­тельно охарактеризованных реактивов или моделей биологического исследования.

ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO

Биологические определения могут выполняться на моделях in vivo или in vitro путем оценки действия постепенно меняющихся доз препарата сравнения или стандарта и интерполяции физиологиче­ского эффекта, вызываемого гормоном, количеством которого в пробе неизвестно. Как правило, в качестве относительно специ­фичного показателя оценивают определенную реакцию, на дейст­вие гормона. Например, сравнивают реакцию массы органа-мише­ни на действие различных доз неизвестного и стандартного гормо­нального препарата. Для того чтобы результаты определения имели силу, кривые доза—реакция для препарата сравнения и не­известной пробы должны быть параллельными. Демонстративным примером служит биологическое определение активности ЛГ и ХГЧ in vivo по влиянию на массу вентральной части предстатель­ной железы. Лютеинизирующий гормон (гормон гипофиза) и ХГЧ (плацентарный гормон) обладают неотличимой биологической активностью. При этом исследовании постепенно увеличивающие­ся количества экстракта мочи вводят подкожно в дробных дозах гипофизэктомированным неполовозрелым самцам крыс на протя­жении нескольких дней и в конце этого периода определяют массу вентральной части предстательной железы. Точно так же вводят постепенно увеличивающиеся дозы препарата сравнения, обладающего известной удельной биологической активностью ЛГ или ХГЧ, и массу вентральной части предстательной железы сравни­вают с таковой у животных, получавших неизвестный препарат. Этот биологический метод адекватен для определения биологиче­ской активности как ЛГ, так и ХГЧ, поскольку оба гормона сти­мулируют синтез и секрецию тестостерона клетками Лейдига крысы, что в свою очередь через ряд биохимических этапов приводит к увеличению размеров вентральной части предстательной железы животного. Увеличение массы этого органа пропорционально коли­честву тестостерона, выделяемого семенниками, стимулированны­ми ЛГ и ХГЧ. Гипофизэктомированных животных используют для того, чтобы исключить синтез и секрецию тестостерона в ответ на эндогенный Л Г. Этот метод является одним из классических и все еще применяется для характеристики препаратов ЛГ и ХГЧ. Он был впервые предложен более 40 лет назад Greep и соавт., а впо­следствии модифицированы [1, 2].

Поскольку наклоны кривой доза-реакция от одного биологиче­ского определения к другому могут значительно варьировать даже при использовании одного и того же препарата, то каждый раз при определении необходимо производить статистический анализ на параллелизм между наклонами и однородностью отклонений кривых доза—реакция для стандарта или препарата сравнения и неизвестного препарата. В идеальном случае следует определить эффект не менее, чем в 3 достаточно отдаленных друг от друга точ­ках кривой доза—реакция с использованием проб от 3—5 животных на каждую точку для стандартного и неизвестного препарата. Только при параллелизме и гомогенности отклонений между стан­дартом и испытуемым препаратом можно сделать достоверный вывод о биологической активности и ее доверительных границах применительно к испытуемому препарату. При отсутствии такого параллелизма об активности испытуемого препарата судить нель­зя. Легко убедиться, что при биологических исследованиях любого типа не должно определяться действие в одной точке.

За многие годы предложено огромное число методов биологиче­ского тестирования in vivo . Некоторые из них достаточно грубы, нечувствительны и неспецифичны, например инсулиновые судоро­ги у мышей. Другие биологические методы значительно более спе­цифичны и чувствительны и продолжают применяться для харак­теристики очищенных гормональных препаратов.

ИССЛЕДОВАНИЯ IN VITRO

Большинство методов in vivo требует относительно больших объе­мов плазмы, мочи или тканевых экстрактов, содержащих достаточ­ное количество гормона, чтобы вызвать значимый биологический эффект. В связи с этим подобные исследования, хотя они очень важны для исходной характеристики различных гормональных препаратов, оказываются непригодными для рутинного клиниче­ского применения. За последние несколько лет разработаны раз­личные методы биологического исследования in vitro . Они не толь­ко специфичны, но и требуют значительно меньших объемов тка­невых экстрактов или биологических жидкостей, что отражает их большую чувствительность. К сожалению, такие методы требуют уровня квалификации, пока еще не доступного для большинства лабораторий, осуществляющих рутинные клинические анализы.

Как правило, критерием сравнения служат различные дозы известного гормонального препарата, по отношению к которым можно интерполировать реакцию, вызываемую неизвестной про­бой. Различные дозы или объемы неизвестной пробы исследуют в той же самой системе наблюдения, а варианты реакции как на не­известный препарат, так и на препарат сравнения или стандарт анализируют на параллелизм и гомогенность отклонений. Послед­нее требование обязательно для любых определений гормонов как in vivo , так и in vitro .

Примером биологической системы in vitro служат клетки Лей­дига, или интерстициальные клетки. Под влиянием стимуляции ЛГ пли ХГЧ клетки Лейдига синтезируют и секретируют тестостерон в количестве, зависимом от дозы стимулирующего гормона. С помо­щью известных методик [3] клетки Лейдига можно отделить от семенных канальцев. Эти клетки равномерно распределяют по пластинкам для клеточных культур и стимулируют различными концентрациями стандартных препаратов ЛГ и ХГЧ и различны­ми объемами неизвестной пробы. Тестостерон секретируется в культуральную среду, и его концентрация определяется специфи­ческим радиоиммунологическим методом.

При биологических исследованиях in vitro могут использовать­ся различные показатели; к ним относятся изменения концентра­ции стероидов, ферментов или циклических нуклеотидов. Вообще говоря, определения in vitro более чувствительны, чем соответству­ющие им определения in vivo , и требуют значительно меньших объемов экстрактов сыворотки, ткани или мочи. Однако при ин­терпретации результатов биологического исследования in vitro необходима особая осторожность, поскольку в такой системе гор­мон может быть биологически активным, a in vivo оказывать очень слабое действие. Это расхождение отражает тот факт, что гормон должен не только связываться со специфическим участком клеточ­ной поверхности и «запускать» определенную последовательность биохимических сдвигов, но и быть доставленным к соответствую­щим клеточным рецепторам в высокой концентрации, чтобы насы­тить достаточное для воспроизведения эффекта число рецепторов. В некоторых случаях в силу будто бы небольших модификаций структуры гормона его клиренс может изменяться в значительной степени.

Для того чтобы гормон вступил во взаимодействие с рецепто­ром, он должен быть биологически активным, т. е. иметь соответ­ствующую конформацию для связывания специфическим рецепто­ром с высоким сродством или прочностью связи. Однако гормон может быть биологически активным in vitro , но не обладать значи­тельной биологической активностью in vivo в силу измененного из-за своих структурных особенностей метаболического клиренса. При исследовании биологической активности десиалилированного ХГЧ in vivo и invitro обнаруживаются существенные расхождения ее [4—7]. После лишения молекулы ХГЧ сиаловой кислоты (десиалилация) in vitro гормон оказывает такой же, если не больший, биологический эффект, что и его нативная, полностью сиалилированная молекула [6, 7]. С другой стороны, in vivo он проявляет очень небольшую биологическую активность, отражающую сте­пень десиалилации его молекулы. Это расхождение определяется значительно более коротким периодом полужизни десиалилированного ХГЧ в плазме по сравнению с интактным гормоном [5]. В свя­зи с этим десиалилированный ХГЧ in vivo достигает своих клеток-мишеней в концентрации, недостаточной для воспроизведения значительного биологического эффекта.

Методы определения одного и того же гормона в системах in vitro обычно более чувствительны, чем в системах in vivo . Неко­торые методы биологического исследования in vitro обладают даже большей чувствительностью, чем радиоиммунологические методы определения концентрации гормона. Методы биологического ис­следования in vitro , в которых в качестве показателя эффекта используются не специфическое рецепторное связывание или ак­тивация аденилатциклазы, а другие биохимические процессы, обычно в десятки, а то и сотни раз более чувствительны, чем радиоиммунологические методы. Методы биологического определения гормонов in vitro в настоящее время не входят в число рутинных способов оценки состояния больного, за исключением тех редких случаев, когда можно предположить расхождение биологической и иммунологической активности гормона.

ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эти методы представляют собой варианты описанных биологиче­ских исследований in vitro . Они обычно обладают большей чув­ствительностью, чем радиоиммунологические методы, но значи­тельно более громоздки и дороги при расчете на одно определение. Результаты цитохимических биологических исследований количе­ственно оценивают на гистологических срезах с помощью специ­ального устройства — микроденситометра. Гистологические срезы готовят из специфических для данного гормона тканей или клеток-мишеней, до того подвергшихся воздействию разных концентра­ций стандартного и испытуемого гормона. С помощью денситомет­ра сканируют область диаметром 250—300 нм для количественной оценки цветной реакции, обусловленной изменением редокс-состояния объекта под влиянием гормональной стимуляции. Для коли­чественного анализа используют гистологические красители, чув­ствительные к этим изменениям.

Первая система цитохимического биологического исследования была разработана для АКТГ, и тканью-мишенью в этой системе служила кора надпочечников [8]. Другие способы биологического определения АКТГ либо слишком малочувствительны, либо требу­ют больших объемов плазмы. Таким образом, цитохимическое определение редокс-состояния ткани является ценным средством анализа нормальной и измененной функции системы гипотала­мус—гипофиз—надпочечники по уровню АКТГ. Разработан цито­химический метод определения и Л Г, но при этом встретились су­щественные трудности, связанные со значительными колебаниями результатов разных определений и непостоянной чувствительно­стью объекта, что, возможно, отражает известные биологические расхождения у разных животных [9]. Чувствительные специфиче­ские цитохимические методы предложены для определения парат­гормона, АД Г и тиротропина [10, 11]. При дальнейшем усложнении оборудования, которое позволит увеличить число исследова­ний в одном определении, этот метод может найти более широкое применение. Он особенно привлекателен потому, что не требует использования радиоактивных соединений. Цитохимические мето­ды нешироко применяются в клинике и используются в основном в качестве чувствительного способа в научных исследованиях.

Таблица 5—1. Биологические методы определения гормонов in vivo и in vitro

In vivo (гипофизэктомированные крысы)

Снижение уровня аскор­биновой кислоты в надпочечниках

In vivo (голодные кры­сы с водной нагруз­кой)

Снижение скорости мочевыделения или уве­личение удельной мас­сы мочи

In vitro (полоски желч­ного пузыря кролика)

In vivo (неполовозре­лые самки крыс)

Увеличение массы яич­ников

In vivo (гипофизэктомированные крысы)

Ширина некальнифицированного эпифизарно­го хряща большебер­цовой кости

In vivo (21-дневные гипофизэктомированные крысы)

Увеличение массы вент­ральной части пред­стательной железы

In vitro (изолированные клетки Лейдига)

Увеличение синтеза и секреции тестостерона в культуральную среду

In vitro (корковый слой почек крыс)

In vitro (эксплантаты молочной железы мы­ши)

Активность лактозаминсинтетазы или синтез фосфопротеина

In vitro (активность ре­нина)

Образование ангиотензи­на I из субстрата ре­нина

In vitro (тазовые руди­менты 11-дневных ку­риных эмбрионов)

1. In vivo (интактные мыши, получившие предварительно 131I и тироксин)

1. Высвобождение 131 I из щитовидной железы в кровь

2. In vitro (цитохимиче­ский, сегменты щито­видной железы мор­ской свинки)

2. Активность лизосом­ной нафтиламидазы

В табл. 5—1 перечислены различные биологические методы in vivo и in vitro , применяемые для определения полипептидных гормонов. Для многих гормонов специфические чувствительные методы биологического определения не разработаны.

ЛИГАНДНЫЙ АНАЛИЗ

РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Радиоиммунологические методы в настоящее время, вероятно, наи­более широко применяются для количественного определения гормонов и многих других соединений в биологических жидкостях. Как показывает само название, радиоиммунологический метод представляет собой иммунологическое исследование, в котором ис­пользуют меченые гормоны или связывающие их антитела. Более 20 лет назад Berson и Yalow [26] предложили радиоиммунологиче­ский метод определения инсулина. Этот метод основывался на их наблюдении, согласно которому в периферической крови больных диабетом, получавших инсулин, присутствует белок (который, как было показано позднее, является глобулином), связывающий инсулин, меченный 131 I Значение этих данных и последующей раз­работки радиоиммунологического метода определения инсулина подчеркивается присуждением Yalow и Berson нобелевской пре­мии. Вскоре после первых сообщений этих исследователей други­ми лабораториями были разработаны и описаны соответствующие методы для определения других гормонов. В этих методах приме­няются либо антитела, либо сывороточные белки, связывающие определенный гормон или лиганд и несущий радиоактивную мет­ку-гормон, конкурирующий со стандартным гормоном или гормо­ном, присутствующим в биологической пробе.

Термодинамически взаимодействие антигена и антитела можно рассматривать как реакцию псевдопервого порядка, которая схе­матически может быть представлена следующим образом

г де Аг — антиген или гормон, AT — антитело к антигену или гормону, Аг — радиоактивно меченный антиген или гормон. Kd — константа скорости диссоциации. Ка — константа скорости ассоциации.

Рис. 5—1. Кривые доза—реакция, полученные с помощью трех разных методов определения гормонов. а —преобразования данных в системе logit-координат, где N—импульсы, обуслов­ленные неспецифическим связыванием, Во — максимальное число импульсов свя­занного гормона, когда в инкубационной среде присутствуют только антитела и меченый гормон; б — данные представлены как отношение импульсов связанного гормона (В) к импульсам ( F ) против логарифма концентрации гормона; в — кривая доза — реакция для определения стероидного гормона в координатах В/Т против дозы гормона, где Т — общее число импульсов.

Реакция антиген—антитело обратима, но скорость диссоциации комплекса антиген—антитело значительно меньше, чем скорость его ассоциации. Количество гормона, связанное с антителом, явля­ется результирующей скоростей ассоциации и диссоциации.

Поскольку в каждую пробирку вносят постоянную концентра­цию антител и меченого гормона, количество импульсов, связан­ных с антителами, должно зависеть от концентрации немеченого гормона, добавляемого в виде стандарта или неизвестной пробы. Чем выше концентрация немеченого гормона, тем меньшим ока­зывается количество импульсов, связанных с антителами, присут­ствующими в системе в фиксированной концентрации. На рис.5—1 приведены различные часто применяющиеся способы графическо­го изображения результатов радиоиммунологических исследований. Верхний график представляет собой кривую доза—реакция в логарифмических координатах, где по оси ординат отложено чис­ло импульсов гормона, связанного с антителами, приведенное к максимальному числу связанных импульсов (Во), когда инкубиру­ются только антитела и меченый гормон (без немеченого). Это по­строение в системе logit — log координат обычно представляет собой прямую линию, что облегчает визуальную интерполяцию количе­ства гормона в неизвестной пробе. С целью получения прямой линии, облегчающей визуальную интерполяцию количества гор­мона в неизвестных пробах, применяют различные способы транс­формации данных. Большинство результатов радиоиммунологиче­ских определений подвергается машинной обработке, позволяю­щей избежать утомительных и длительных расчетов.

Получение высокоочищенных гормонов дало возможность раз­работать чувствительные радиоиммунологические методы для точ­ного измерения низких физиологических уровней циркулирующих гормонов, требующие относительно малых объемов биологических жидкостей. Для чувствительных радиоиммунологических опреде­лений необходимо следующее 1 — высокоочищенный гормон, несущий радиоактивную метку с достаточно высокой удельной активностью, чтобы в каждую про­бирку можно было вносить только «следовые» его количества; 2 — реактивы, используемые в реакции присоединения метки, не должны изменять иммунореактивности гормона в существен­ной степени; 3 — антитела с достаточно высокой чувствительностью (сродст­вом) и специфичностью, чтобы определить низкие физиологиче­ские уровни нужного гормона; 4 — соответствующий препарат сравнения, по отношению к ко­торому можно было бы интерполировать неизвестные концентра­ции гормона в неизвестной пробе. Препарат сравнения и исследуе­мый гормон должны одинаково взаимодействовать с антителами и давать параллельные кривые доза—реакция.

В надежных системах для радиоиммунологического определе­ния концентрация меченого гормона и антител фиксирована. В связи с этим по мере увеличения концентрации немеченого гор­мон уменьшается вероятность связывания меченого гормона с антителами, что обусловливает обратное соотношение между чис­лом молекул меченого гормона, связанных с антителами, и концен­трацией немеченого гормона в реакционной смеси.

В отношении взаимодействия антигена с антителами прини­маются некоторые допущения 1 — присутствующий гормон гомогенен и взаимодействует с антителами с равным сродством независимо от того, содержит он радиоактивную метку или нет; 2 — присутствующие антитела гомогенны и одна молекула ан­титела взаимодействует с одной молекулой гормона; 3 — два разных вида молекул — гормон и антитела — реагиру­ют до тех пор, пока между ними не установится равновесие; 4 — применяется эффективное средство разделения связанного с антителами и свободного гормона, причем методика разделения не нарушает исходного равновесия, достигнутого между гормоном и антителами.

Хотя перечисленные допущения идеализируют ситуацию, но они приблизительно очерчивают условия радиоиммунологических исследований. С помощью соответствующих методов удается опре­делить такие концентрации гормонов, которые обычно не подда­ются определению большинством биологических методов in vivo . Под чувствительностью или наименьшей определимой дозой пони­мают ту концентрацию гормона, которая вызывает значимое изме­нение процента связывания меченого гормона с антителами при сравнении с «пустой» пробой. Чувствительность определения за­висит от сродства гормона к специфическим антителам.

ЙОДИРОВАНИЕ

Наиболее широко применяемым методом йодирования белков яв­ляется, вероятно, модифицированный метод, предложенный Green ­ wood , Hunter и Glover [27]. В нем используется окисляющий агент хлорамин Т, превращающий Na 125 I в свободный йод, который затем включается главным образом в остатки тирозина. При использова­нии этого метода могут йодироваться и остатки гистидина. Для сохранения максимальной иммунореактивности необходимо, чтобы на молекулу гормона приходился только один атом 131 I или 125 I, поскольку большая степень йодирования обычно снижает иммуно­логическую и биологическую активность гормона, изменяя его химические свойства [27].

В настоящее время применяют и другие способы йодирования. Второе по популярности место занимает, по-видимому, фермента­тивный метод с использованием лактопероксидазы [28, 29]. В при­сутствии перекиси водорода, добавляемой непосредственно в реак­ционную смесь, лактопероксидаза превращает Na 125 I в свободный йод, который избирательно включается в остатки тирозина. По­скольку перекись водорода является сильным окислителем, дейст­вие ее высоких концентраций на гормон может изменять его химические свойства; поэтому перекись водорода обычно добавля­ют двумя или тремя небольшими порциями, которые быстро ис­пользуются в реакции. Другим, более новым, но менее распростра­ненным методом йодирования, является метод, разработанный Bolton и Hunter [30]. В нем возможность вредных эффектов хлора­мина Т, бисульфита натрия и перекиси водорода, применяемых в двух других методах йодирования, на гормон сводится к минимуму. С помощью хлорамина Т йодируют промежуточное соединение-­сложный эфир, образованный N-оксисукцинимидом и 3-(р-оксифенил)-пропионовой кислотой, которое затем конденсируется с аминогруппами полипептидного гормона. Такой подход позволяет избежать воздействия на гормон сильных окислителей или восста­новителей. Эта методика несколько громоздка и пока не получила широкого распространения.

Рис. 5—2. Схематическое изо­бражение молекулы g -глобулина или антитела. Участки, «узнающие» гормон, могут содержать разные аминокис­лотные области легких и тя­желых цепей иммуноглобули­на. Легкие цепи ковалентно связаны с тяжелыми дисуль­фидными мостиками, обозна­ченными знаком S . Одна дисульфидная связь имеется и между двумя тя­желыми цепями. Недавно полученные данные указывают на Y-образную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, в которой участки коплексирования с антигеном расположены в верхней части этой фигуры.

В настоящее время используют не Na 131 I , a Na 125 I , поскольку он обладает значительно большим периодом полураспада: 59 дней вместо 6. Однако при работе с 125 I необходима особая тщатель­ность, так как его удельная g -активность значительно ниже, чем у 131 I. Стероидные гормоны и витамин D метят тритием, что позволя­ет получить более высокую удельную активность, чем с помощью метки 14 C. Полипептиды, не имеющие в своем составе остатков ти­розина или гистидина, можно модифицировать, вводя или присо­единяя тирозин к их структуре без видимого изменения конформа­ции нативного соединения. Выбирают такие замещения, которые с наименьшей вероятностью изменят конформацию молекулы.

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТКИ

Антитела принадлежат к классу иммуноглобулинов и являются преимущественно g -глобулинами (IgG). Молекула IgG состоит из 4 полипептидных цепей: двух тяжелых и двух легких, располо­женных симметрично и ковалентно связанных друг с другом дисульфидными мостиками. Схематическое изображение этой моле­кулы приведено на рис. 5—2. Взаимодействие антигена, или лиган­да, с антителом можно уподобить контакту «замка и ключа». Форма комплексобразующего участка антитела комплементарна тако­вой участка антигена. Связь между антигеном и антителом обу­словлена сочетанием электростатических, водородных и ван-дер-ваальсовых взаимодействий [31, 32]. Форму связывающего участка и тем самым сродство и специфичность связи молекулы IgG с нужным антигеном определяет аминокислотная последователь­ность комплексообразующего участка этой молекулы [33].

Для получения системы определения гормона высокоочищен­ный гормон вводят лабораторным животным, индуцируя у них синтез иммуноглобулинов, обладающих достаточно высокой специ­фичностью и чувствительностью, чтобы их можно было использо­вать для радиоиммунологических определений. Как правило, со­единения с размерами молекул менее 1000 дальтон недостаточно иммуногенны и для придания им свойств активных нммуногенов их нужно соединять с молекулой-носителем. Иммуногеном назы­вается вещество, способное индуцировать образование антител. Для того чтобы обеспечить возможность индукции антителообразо­вания, небольшие молекулы, или гаптены, можно соединять с та­кими веществами, как альбумин, тироглобулин или гемоцианин. Иммуногенная реакция обычно выше в случае введения тех бел­ков-носителей, которые и сами являются высокоиммуногенными. В связи с этим такие вещества, как альбумин, тироглобулин и ге­моцианин являются более подходящими белками-носителями, чем полилизин или другие синтетические полиаминокислоты, при ин­дукции синтеза специфических антител к конъюгированным гаптенам. Стероиды, тиреоидные гормоны (трийодтиронин и тироксин) и различные формы витамина D, как правило, требуют конъюга­ции с белками-носителями. Необходимо тщательно следить за тем, чтобы в процессе конъюгации стероидов и других гаптенов прини­мала участие та часть молекулы, изменение которой в наименьшей мере сказывалось бы на стереоспецифичности этой молекулы. На­пример, антитела к 17 b — эстрадиолу лучше всего образуются при ковалентном присоединении его 6-кетоаналога к альбумину, т. е. при сохранении интактности 3- и 17-гидроксильных групп, равно как и кольца А, стероида. Последнее особенно важно, поскольку именно эти структуры придают данному эстрогену специфичность.

За многие годы разработаны разнообразные методики иммуни­зации, но все они, по существу, являются модификациями ориги­нальной методики Фрейнда [34]. Эмульсия, содержащая гормон, или иммуноген, соответствующее масло и убитые нагреванием ту­беркулезные палочки, вводят внутри- или подкожно. С получе­нием высокоочищенных гормонов и других производных удалось разработать методику иммунизации малыми количествами имму­ногена [35]. Имеются надежные экспериментальные доказательст­ва образования специфических обладающих высоким сродством антител к малым дозам иммуногена [36]. Именно малые дозы иммуногена с наибольшей вероятностью обусловливают продук­цию специфических иммуноглобулинов теми клетками, которые образуют антитела с наиболее высоким сродством к иммуногену. В связи с этим при применении больших доз иммуногена повыша­ется вероятность выработки антител, обладающих низким сродст­вом. При введении очень больших доз иммуногена у иммунизиро­ванных животных может наблюдаться феномен толерантности, когда антитела вообще не образуются или образуются в очень низких титрах [37, 38]. После начальной иммунизации обычно дол­жно пройти минимум 6 нед, чтобы появились значительные титры антител. Сродство антител продолжает увеличиваться и достигает максимума обычно между 8-й и 12-й неделей после начальной иммунизации [35, 39]. Эмпирически установлено, что повторная иммунизация животного обеспечивает лучшую реакцию в том слу­чает, если повторные инъекции производят в период снижения титра циркулирующих антител. При повторном введении 1/2 или 1/4 дозы гормона, использованной при первичной иммунизации, значительное повышение титра циркулирующих антител наблюдается уже через несколько дней. Повторную иммунизацию животного следует производить в ту же анатомическую область, в кото­рую иммуноген вводили первый раз. Больше того, для воспроизве­дения реакции «по памяти» уже не нужно вводить убитые нагре­ванием туберкулезные бациллы, которые могут увеличивать забо­леваемость и смертность животных.

Для получения специфических антител следует выбирать те виды животных, которые легко доступны, не слишком дороги и у которых структура своего собственного эндогенного гормона зна­чительно отличается от применяемого для иммунизации. Напри­мер, хотя СТГ у животных разных видов обладают одинаковой биологической активностью, но они существенно различаются по аминокислотному составу. Эти различия в первичной структуре, как и некоторые другие недостаточно охарактеризованные факто­ры определяют иммуногенность гормона для других видов живот­ных. В некоторых случаях аминокислотные последовательности могут различаться относительно слабо и поэтому нужно с особой тщательностью подбирать вид животного, которому вводят гормон. Например, структура инсулина у человека, кролика и овцы почти одинакова, но инсулины человека и морской свинки различаются сильнее. Для получения специфических антител к инсулину чело­века лучше всего использовать именно морских свинок [40].

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ СИСТЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

После получения антител от иммунизированного животного и опре­деления их концентрации проводят оценку чувствительности и спе­цифичности антисыворотки. Концентрацию антител в сыворотке вначале определяют по связыванию меченого гормона, который применяли для иммунизации, причем используют разные разве­дения антисыворотки. Этот способ называется титрованием и под титром понимают концентрацию молекул антител в сыворотке. После нахождения той концентрации антител, которая в равновес­ных условиях связывает 30—40% меченого гормона, определяют чувствительность и специфичность антител. Получение и харак­теристика специфических систем для определения ХГЧ и инсули­на очень подробно изложена в других публикациях и может слу­жить ориентиром при получении других специфических радиоим­мунологических систем определения гормонов.

В реальных условиях антитела, получаемые для использования в клинических радиоиммунологических исследованиях, содержат популяцию иммуноглобулинов, обладающих различной специфич­ностью и сродством. Следует выбрать антисыворотку, содержащую популяцию антител с достаточно высоким сродством и специфич­ностью к тому гормону, который предстоит определить. На прак­тике выбрать такую популяцию антител с высоким сродством мож­но путем достаточно высокого разведения антисыворотки, чтобы роль других популяций антител, обладающих низшим сродством и, возможно, неспецифических, стала относительно несущественной.

Рис. 53. Кривая доза — реакция для ХГЧ- a , определяемого в гомологич­ной для него радиоиммунологической системе. Три кривые доза — реакция для ХГЧ-а получены в условиях, отличающихся только концентрацией антител к ХГЧ- a . При увеличении начального отношения В/Т с 25 до 60% вследствие увеличения концентрации антител точка на оси абсцисс, соот­ветствующая 50% снижению исходного связывания, сдвигается с 0,12 до 0,24 нг в пробе. 1 — В/Т=25%: 2 — В/Т=32%: 3 — В/Т =60%. Обозначения см. на рис. 5-1;

При выборе такого разведения антисыворотки, которое отлича­ется от использованного вначале для характеристики системы, необходимо заново определить ее чувствительность и специфич­ность, поскольку в ином разведении концентрация других по­пуляций антител может оказаться относительно высокой, и разве­денная антисыворотка будет обладать меньшей чувствительностью и специфичностью. Такая ситуация графически представлена на рис. 5—-3, на котором кривая доза—реакция для высокоочищенного лиганда смещена вправо, что отражает снижение чувствитель­ности системы по мере увеличения концентрации антител. Поскольку гормоны содержатся в крови в относительно низких концентрациях (10 –12 —10 –9 М), необходимо отбирать антитела с высоким сродством и специфичностью. Сродство и специфичность каждого разведения антител нужно определять эмпирически. Боль­ше того, антисыворотка, получаемая от одного и того же животно­го в разное время после иммунизации, может обладать сущест­венно различающимися сродством и специфичностью по отноше­нию к гормону, которым иммунизировали животное.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ СИСТЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Следует учитывать как структуру, так и степень очистки гормо­на, используемого для иммунизации. Гликопротеиновые гормоны человека (ЛГ, ФСГ и ТТГ), а также хорионический гонадотропин, имеют общую четвертичную структуру и состоят из двух различ­ных субъединиц, обозначаемых как a и бета [42]; a -субъединица, по существу, совершенно одинакова во всех этих гормонах с точки зрения ее аминокислотной последовательности. Иммунологическую и биологическую специфичность этим гормонам придает b — субъ­единица. В связи с этим необходимо тщательно выбирать антисы­воротку, полученную к любому из гликопротеиновых гормонов, и тщательно проверять, достаточно ли она специфична, чтобы мож­но было определить концентрацию данного гормона в присутствии в той же пробе высокого уровня других гликопротеиновых гормо­нов. В некоторых случаях перекрестной реакции, обусловленной общностью антигенных детерминант, можно избежать, адсорбируя антитела на общем антигене. Например, если антисыворотка к ТТГ обнаруживает перекрестную реакцию с ФСГ и ЛГ и эта перекрест­ная реакция обусловлена общими детерминантами a -субъединицы, то данную антисыворотку можно очистить с помощью свободной a -субъединицы или ХГЧ, который содержит a -детерминанты. Такая «очищенная» антисыворотка в идеальном варианте специ­фична по отношению к ТТГ и практически не менее чувствительна к этому гормону.

Проблема еще больше усложняется в связи с тем, что b — субъ­единицы ХГЧ и ЛГ обладают выраженной структурной гомологи­ей, что и делает биологическую активность этих двух молекул неотличимой. В результате антитела, образующиеся к целым моле­кулам ЛГ и ХГЧ, по всей вероятности, будут взаимодействовать с любой из них и обоими вместе. Поскольку некоторые опухоли экто­пически секретируют ХГЧ и поскольку высокие концентрации ХГЧ присутствуют и в нормальных условиях при беременности, при обычном определении ЛГ должны получать завышенные ре­зультаты, трактовать которые нужно с большой осторожностью. Наилучшим клиническим доказательством преимущественного присутствия в периферической крови ХГЧ, а не ЛГ, является рез­кое расхождение концентраций ЛГ и ФСГ в одной и той же пробе; Загрязнение гормонального препарата, используемого для им­мунизации животного, другим гормоном может создавать и другие методические проблемы. Даже в высокоочищенных препаратах гормонов гипофиза человека присутствуют небольшие, но сущест­венные примеси других гипофизарных гормонов. Это справедливо также для гормонов, получаемых в чистом виде из поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта. Очевидно, что у иммуни­зированного этими гормонами животного могут образовываться антитела к любому из попавших в его организм гормонов, в том числе и к тем, которые присутствовали в виде примесей, В связи с этим необходимо знать источник гормона, поскольку в процессе его очистки могут одновременно очищаться и другие гормоны, попадающие в конечный препарат. В идеальном случае следовало бы проверить структурное сходство гормонов, так как именно оно может служить основой перекрестной реактивности некоторых ан­тисывороток по отношению к разным гормонам.

ЭФФЕКТ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ

Поскольку между различными стероидами, между тироксином и трийодтиронином и некоторыми их метаболитами и между различ­ными формами витамина D отмечается выраженная структурная гомология, не всегда возможно получить антисыворотку, доста­точно специфическую, чтобы без предварительного применения методов экстракции и разделения избирательно определять эти гормоны и их метаболиты. Некоторые гормоны циркулируют в кро­ви, будучи связанными со специфическими белками-переносчика­ми или более рыхлой связью с альбумином. Для того чтобы избе­жать загрязнения радиоиммунологической системы связывающими белками сыворотки, необходимо вначале экстрагировать гормон соответствующим растворителем. Начальную экстракцию следует проводить и при малой специфичности антител к гормону. В неко­торых случаях может оказаться достаточной дифференциальная экстракция, но в других необходимо произвести хроматографическое разделение гормонов. К наиболее распространенным средст­вам разделения структурно близких стероидов относятся тонко­слойная хроматография и хроматография на колонках сефадекса LH -20. Поскольку крупные полипептидные гормоны циркулируют в крови, не будучи связанными с белками-переносчиками, началь­ный этап экстракции в этом случае не нужен, и аликвоту сыворот­ки можно прямо помещать в пробирку для анализа. Однако содер­жащиеся в сыворотке протеазы могут обусловить занижение кон­центрации некоторых полипептидных гормонов. Если разрушение гормона существенно изменяет его структуру, он может и не реа­гировать с антителами. В результате появляется необходимость добавления в пробу ингибиторов ферментов, чтобы противодейст­вовать эффекту протеаз. К ингибиторам протеаз, добавляемых в сосуды с пробами на АКТГ, глюкагон и другие гормоны, которые могут подвергаться быстрой протеолитической деградации, отно­сятся трасилол и бензамидин.

В отношении некоторых полипептидных гормонов отмечаются неспецифические эффекты сывороточных белков. Эти неспецифи­ческие белковые эффекты можно нивелировать, добавляя пустую сыворотку в пробирки для исследования, не содержащие сыворот­ки, с тем, чтобы все пробирки содержали сравнимые концентрации мешающих определению сывороточных белков. Каждую антисыворотку можно эмпирически проверять на неспецифический эффект белка в отношении реакции антиген—антитело.

РАЗДЕЛЕНИЕ СВЯЗАННОГО И СВОБОДНОГО ГОРМОНА

Существуют различные способы разделения связанного с антите­лами и свободного гормона. В системах для полипептидных гормо­нов обычно применяют «методику вторых антител». Поскольку исходный комплекс гормона с антителом растворим, с помощью простого центрифугирования разделить связанный и свободный гормон невозможно. В связи с этим после достижения равновесия между гормоном и первыми антителами добавляют вторые антите­ла, полученные на g -глобулин животного того вида, у которого получали первые антитела. Поскольку вторые антитела будут те­перь связывать образовавшийся комплекс между гормоном и пер­выми антителами, то возникнет вторичный нерастворимый моле­кулярный комплекс, и связанный свободный гормон можно будет отделить простым центрифугированием. Например, если антите­ла к гастрину вырабатывались у кролика, то вторые антитела к кроличьему g -глобулину следовало бы получать у животного дру­гого вида (лошади, овцы или козы). Лошадиный антикроличий глобулин нужно было бы добавить в пробирку для анализа после установления равновесия в реакционной смеси, содержащей мечен­ный 125I гастрин и кроличью антигастриновую сыворотку. Время, необходимое для установления равновесия реакции со вторыми антителами, зависит от концентрации кроличьей сыворотки-носи­теля в реакционной смеси. Например, если первые антитела к гас­трину получены от кролика, в пробирку для анализа можно допол­нительно добавить кроличью сыворотку-носитель или глобулин. Если кроличья сыворотка-носитель занимает 2% объема пробир­ки, то для осаждения кроличьего g -глобулина следует добавлять относительно большой объем вторых антител (0,05—0,2 мл). Поскольку равновесие достигается за время, определяемое первым законом действующих масс, то оно должно достигаться относи­тельно быстро (за несколько часов). Это время вначале находят эмпирически и подбирают необходимый наименьший оптимальный объем вторых антител для каждой их партии, получаемой в лабо­ратории или от торговых фирм. В пробирки для анализа можно добавлять меньшие концентрации сыворотки- носителя, что умень­шит необходимый объем вторых антител, но увеличит время, тре­буемое для достижения равновесия реакции с их участием.

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ ЭНДОГЕННЫЕ АНТИТЕЛА

Если в сыворотке больного присутствуют эндогенные антитела, то при определении, проводимом с помощью метода двойных анти­тел, могут быть получены завышенные результаты. Теоретически меченый гормон, добавленный в пробирку для анализа, свяжется либо с антителами больного, содержащимися в пробе сыворотки, либо с антителами, вносимыми в пробирку. Будучи получены на g -глобулин животного, у которого вырабатывали первые антитела, вторые антитела не должны осаждать гормон, связанный с g -глобулином человека, который останется в виде растворимого ком­плекса в супернатанте. В связи с этим осадок будет обладать мень­шей радиоактивностью, что отразит меньшее содержание связан­ного гормона. Поскольку концентрация гормона в пробе обратно пропорциональна количеству осажденного меченого гормона, то результат определения концентрации гормона окажется ошибочно завышенным. Все это схематически изображено на рис. 5—4. Циркулирующие антитела обычно встречаются у больных диабетом, леченных инсулином. Если у больного подозревают присутствие таких антител, то для разделения связанного с антителами и сво­бодного гормона следует применять не метод вторых антител, а какой-либо иной метод. Этого можно достичь различными путями, в том числе осаждением g -глобулином человека или сульфатом аммония. Для точного определения количества антител к данному гормону в пробе сыворотки больного существует ряд дополнитель­ных приемов.

Рис. 5—4. Схематическое изображение типичной радиоиммунологической реакции с двойными антителами (а). Наряду с добавленными в качестве известного реагента антителами в пробе присутствуют и эндогенные анти­тела к гормону (б). Эндогенные антитела искажают результаты определе­ния концентрации гормона в системе двойных антител, поскольку некото­рые комплексы гормон — антитело не осаждаются вторыми антителами, взаимодействующими с кроличьим (но не человеческим) g -глобулины .

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРОИДОВ

Стероидные гормоны обычно содержатся в сыворотке в связанном с различными белками виде. Поскольку сывороточные белки могут обладать сродством к гормону, сходным со сродством антител, используемых в радиоиммунологическом анализе, то чтобы по­следний дал надежные результаты, гормоны нужно сначала экс­трагировать, т. е. отделить от сывороточных белков. До широкого распространения радиоиммунологических методов кортизол и дру­гие сходные стероиды, которые ассоциируются с кортизолсвязывающим глобулином (КСГ), определяли методами конкурентного белкового связывания, в которых использовали этот белок-переносчик. В настоящее время такой подход применяют реже, поскольку при этом приходится характеризовать каждую партию сыворотки, из которой извлекают КСГ, и требуется более детальное разделение стероидов с помощью тонкослойной хроматографии. Необходимость всех этих начальных этапов исследования, требующих дополни­тельного времени, а также более широкий разброс результатов от анализа к анализу отодвинул данный метод на второй план по отношению к радиоиммунологическому.

Наиболее распространенным средством разделения связанных с антителами и свободных стероидных гормонов является покрытый декстраном уголь. Он адсорбирует стероиды, не связанные с анти­телами, и переводит их в осадок. Растворимый же комплекс гор­мон—антитело остается в супернатанте. В системах определения стероидов, в которых используется гормон, меченный тритием, супернатант можно декантировать в сосуд, содержащий жидкий сцинтиллятор. В некоторых системах определения стероидных гормонов используют меченые тирозилированные стероиды. В этих случаях разделение связанного и свободного гормона проводят обычно методом двойных антител.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К МЕТОДУ

Помимо проверки чувствительности и специфичности антисыво­ротки, а также возможности проявления неспецифических эффек­тов белков плазмы или сыворотки, необходимо убедиться в надеж­ности стандартного гормона, используемого для интерполяции ко­личества гормона в биологической пробе. Сходство реакции на стандарт и клинический образец нужно оценивать путем построе­ния кривых доза—реакция для каждого из них, используя различ­ные дозы гормона или различные объемы пробы и проверяя парал­лельность этих кривых. Как отмечалось в разделе, посвященном биологическим методам, интерполяция дозы возможна только -в случае существования такой параллельности. Для контроля каче­ства гормонального стандарта нужно при каждом исследовании не только проверять наклон кривой доза—реакция, но и находить на оси абсцисс точку, которая соответствует 50% снижению исход­ного связывания. Кроме того, дополнительно следует в каждой системе радиоиммунологического определения гормона с парал­лельными пробами анализировать пулы сывороток, заведомо содер­жащих низкие, средние и высокие концентрации определяемого гормона. При радиоиммунологических исследованиях отмечается значительно меньший разброс результатов, чем при использовании биологических методов. В связи с этим в большинстве лабораторий при обычных радиоиммунологических определениях не анализиру­ют разные объемы клинических проб, если не предполагается гете­рогенность гормона.

Наконец, должна осуществляться независимая проверка надеж­ности нового метода радиоиммунологического исследования с по­мощью физиологических коррелятов и какого-либо иного, предпоч­тительнее — биологического, метода определения гормона. Вероят­но, наиболее частыми причинами изменения гормональной секре­ции являются фармакологические или пищевые воздействия, и они часто применяются для того, чтобы выяснить, будут ли ожидаемые физиологические изменения концентрации гормона «улавливать­ся» с помощью нового метода.

РАДИОРЕЦЕПТОРНЫЙ АНАЛИЗ

Принцип радиорецепторного метода по существу не отличается от радиоиммунологического, только гормон, вместо того чтобы связы­ваться с антителами, связывается со специфическим гормональ­ным рецептором плазматической мембраны или цитозоля. Специ­фические рецепторы большинства полипептидных гормонов рас­полагаются на наружной поверхности плазматической мембраны клеток, тогда как рецепторы биологически активных стероидов, а также тироксина и трийодтиронина — в цитозоле и ядрах [43, 44]. Чувствительность радиорецепторного анализа ниже, чем радиоим­мунологического и большинства биологических методов в системах in vitro . Для того чтобы взаимодействовать со своим рецептором, гормон должен иметь соответствующую конформацию, т. е. быть биологически активным. Возможна ситуация, в которой гормон теряет способность связываться со своим рецептором, но продол­жает взаимодействовать с антителами в системе для радиоиммуно­логического анализа. Это расхождение отражает тот факт, что ан­титела и рецепторы «узнают» разные участки молекулы гормона.

Предложен ряд радиорецепторных методов гормонального ана­лиза. Обычно получают ткань специфического для данного гормо­на органа-мишени и с помощью стандартных методик выделяют из нее рецепторы. Изолированные рецепторы плазматической мембра­ны в осадке при хранении в условиях температуры менее —20 °С относительно стабильны. Однако солюбилизированные рецепторы полипептидных и стероидных гормонов, выделенные из плазмати­ческих мембран либо из цитозоля и не связанные с лигандами, ока­зываются нестабильными, что проявляется снижением их способ­ности связывать специфические гормоны, даже если они храни­лись в замороженном виде, сравнительно недолго.

Йодирование полипептидных гормонов должно осуществляться с помощью методов, изменяющих их биологическую активность лишь в минимальной степени. Для сохранения биологической активности на каждую молекулу гормона должен прихо­диться один атом йода. Чрезмерное йодированно обычно зна­чительно изменяет биологическую и иммунологическую актив­ность гормона. Кроме того, некоторые реактивы, используемые в процессе йодирования, являются сильными окислителями или восстановителями, и поэтому их концентрация должна быть сведена к минимуму. Применяющиеся в настоящее время методы йодирования описаны ранее.

Рис. 5—5. Скетчардовский график данных, по­лучаемых при радиоре­цепторном исследова­нии.

ХАРАКТЕРИСТИКА ГОРМОНРЕЦЕПТОРНОГО СВЯЗЫВАНИЯ

Для характеристики взаимодействия гормона с рецептором или антителом предложены различные методы математического анали­за. При взаимодействии гормона [Г] с его специфическим рецеп—тором [Р] простая обратимая реакция между двумя молекулами в условиях равновесия может быть охарактеризована как

где [ГР] — гормонрецепторный комплекс. Предполагается, что как гормон, так и рецептор гомогенны и имеют один специфически свя­зывающий участок. Взаимодействие гормона и рецептора далее можно описать следующим образом

где Ка—равновесная константа ассоциации (л/моль или М

1 ), ka — константа скорости ассоциации, k a — константа скорости диссоциации, Kd — константа диссоциации (моль/л, или М).

Зависимость между общей концентрацией рецепторов и концен­трацией занятых рецепторов может быть изображена следующим образом

где [Ро] — общая концентрация рецепторов, [ГР]— концентрация связанных с гормоном рецепторов, а [Р] — концентрация свобод­ных рецепторов.

Преобразуя приведенные выражения, можно получить уравне­ния (5—4а) и (5—46), которые при графическом написании дают обычно прямолинейную зависимость с наклоном, равным — 1/К a , или — К а

Уравнения (5—4а) и (5—46) являются математическим напи­санием графика Скетчарда, в виде которого данные о гормонре­цепторном взаимодействии представляются, вероятно, наиболее часто [45, 46]. Эти уравнения применяются также для характери­стики взаимодействия гормона с антителами. График Скетчарда представлен на рис. 5—5. Точка пересечения кривой с осью абс­цисс представляет собой [Ро), а с осью ординат Као],или (1/ Kd ) [Ро]. Наклон линии равен — Ка, или —1/Kd. Следовательно при графическом изображении данных по отрезкам осей координат можно непосредственно определить [Ро] и [ГР]/[Г]. Для расчета Ка используют следующие рассуждения. Поскольку член —Ка[ГР] из уравнения (5—46) при нулевом количестве связанного гормона [ГР] становится равным нулю, то

где В — концентрация связанного гормона, а F — концентрация свободного гормона, или

Зная молярную концентрацию рецептора, можно определить число связывающих участков на клетку или на массу белка, умно­жив количество молей рецептора на 6,02•10 23 (число Авогадро, или число молекул в моле).

Константы ассоциации, полученные в разных радиорецептор­ных исследованиях, обычно колеблются между 10 –11 и 10 –9 M –1 . Однако не все графики Скетчарда линейны. Их нели­нейность отражает аллостерическое межрецепторное взаимодейст­вие, приводящее к повышению (положительная кооперативность) или снижению (отрицательная кооперативность) связывания гор­мона после начального взаимодействия его с рецепторами. Данные,. полученные в исследованиях по рецепторному связыванию гормо­на, можно преобразовывать дальше, и с помощью графика Хилла выяснить, действительно ли в системе происходят аллостерические взаимодействия [47, 48]. Если наклон прямой на графике Хилла значительно отличается от единицы, то они существуют. При полу­чении нелинейного графика Скетчарда следует учитывать не толь­ко аллостерические взаимодействия, но и другие факторы. К ним относятся артефакты, обусловливаемые проведением анализов в неравновесных условиях, неточной оценкой неспецифического свя­зывания, ошибками в разделении свободного и связанного гормона и значительными различиями сродства к рецептору меченого и не­меченого гормона [49].

ГОРМОНАЛЬНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ СОСТОЯНИЯ

Описан ряд клинических состояний, при которых нарушается вза­имодействие между гормоном и его специфическим рецептором. Такие нарушения объясняют изменением числа рецепторов или их сродства к гормону, а также спонтанным образованием антител к гормональным рецепторам. У больных с атаксией -телеангиэктази­ей может отмечаться резкая инсулинорезистентность вследствие выраженного уменьшения сродства рецепторов к инсулину [50]. У некоторых больных со злокачественной миастенией образуются антитела к экзогенным рецепторам ацетилхолина, что и обуслов­ливает развитие соответствующего клинического синдрома [51]. Подобно этому у больных с acanthosis nigricans клинически выяв­ляется инсулинорезистентность, причем результаты обследования таких больных убедительно свидетельствуют о роли антител к ин­сулиновым рецепторам в имеющейся инсулинорезистентности [52]. Число специфических рецепторов инсулина, приходящееся на каж­дую клетку, может быть снижено при ожирении, вследствие чего у тучных больных уменьшается чувствительность к инсулину. При уменьшении массы тела у этих больных число инсулиновых рецеп­торов на клетку увеличивается и нормализуется чувствительность к инсулину [53]. У некоторых больных с гипертиреозом в крови присутствуют антитела к рецепторам ТТГ. В отличие от больных со злокачественной миастенией и диабетом, у таких больных анти­тела к рецепторам ТТГ могут стимулировать мембранные рецепторы в ткани щитовидной железы, индуцируя повышенную продук­цию и секрецию тироксина и трийодтиронина, что и обусловливает гипертиреоидное состояние [54].

В отдельных случаях концентрация рецепторов стероидных по­ловых гормонов может определять успех определенных видов терапии [55, 56]. Так, вмешательства в деятельность эндокринной системы оказывают благоприятный эффект у женщин, больных раком молочной железы в пременопаузе, у которых раковая ткань содержит рецепторы эстрогенов. Такие вмешательства приносят успех у 50—70% женщин, у которых выявляется значительная концентрация рецепторов эстрогенов в опухоли, и менее чем у 10% больных, раковая ткань у которых не содержит соответствующих рецепторов. В качестве эндокринотерапии применяется обычно хирургическое удаление яичников, надпочечников и гипофиза. Предложены различные антиэстрогенные лекарственные вещества, к которым относятся нафоксидин, тамоксифен и кломифен. Боль­ные в пременопаузе, леченные сочетанием воздействий на эндо­кринную систему, выживают в течение гораздо более длительного срока, чем лица, не получающие соответствующего лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАМЕЧАНИЯ

КОЛЕБАНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА

Контроль за качеством радиоиммунологических систем, равно как и моделями для биологического определения гормонов in vivo и in vitro , настоятельно необходим. Для того чтобы результаты ис­следования имели силу, следует убедиться в параллельности кри­вых доза—реакция для препарата сравнения и неизвестной пробы. Как правило, каждая радиоиммунологическая и биологическая ( in vitro ) система для анализа требует исследований параллельных проб плазмы или гормона, что позволяет оценить колебания ре­зультатов как для данной системы, так и между системами. Кон­троль за качеством систем дает возможность определить стабиль­ность и воспроизводимость результатов. Вариационные коэффици­енты в пределах каждой системы обычно в 2 раза меньше, чем между системами. В связи с этим если ожидаются относительно небольшие, хотя и существенные, различия между пробами, лучше всего анализировать их с помощью одной системы (набора).

СТАБИЛЬНОСТЬ ГОРМОНОВ

После высвобождения из железы некоторые гормоны быстро рас­падаются и циркулируют в крови в виде фрагментов. Лучше всего это видно, вероятно, на примере ПТГ, который вскоре после выде­ления в кровь распадается на аминоконцевой и карбоксильно-концевой фрагменты. Последний фрагмент имеет гораздо более дли­тельный период полужизни в крови, чем аминоконцевой. Однако биологической гормональной активностью обладает именно амино­концевой фрагмент. При выработке антител к нативному ПТГ у иммунизированного животного могут появиться антитела к амино­концевому, карбоксильно-концевому или обоим фрагментам моле­кулы. Нормальные колебания концентрации ПТГ различаются в зависимости от специфичности антител, используемых для его определения. Другие гормоны, такие, как глюкагон и АКТГ, быст­ро разрушаются в плазме под действием содержащихся в ней про­теаз. Для того чтобы избежать этого, необходима специаль­ная обработка проб. Как правило, при получении их в пробирки добавляют ингибиторы протеаз, такие, как трасилол или бензамидин.

Другая методическая проблема возникает в том случае, когда гормоны секретируются в разных формах. Существуют, например, различные формы гастрина — «минигастрин», «малый гастрин», «большой гастрин» и «очень большой гастрин». С помощью боль­шинства методов определения гастрина при непосредственном ана­лизе проб не удается различить эти формы. В результате пробы предварительно следует подвергнуть гель-фильтрации, чтобы убе­диться в присутствии разных физических форм гормона. Это отно­сится и к другим гормонам, таким, как пролактин, инсулин и АКТГ. Более крупные формы обычно являются предшественника­ми меньших биологически активных нативных молекул.

Поскольку концентрация гормонов в сыворотке может изме­няться в зависимости от времени суток, позы больного, метабо­лического состояния и собственного ритма с периодичностью от нескольких минут до нескольких недель, отбор проб необходимо производить в одинаковых условиях. О нормальных колебаниях уровня данного гормона судят обычно на основании анализа проб, собранных в стандартных условиях. Должно быть совершенно ясным, что концентрация гормона, найденная с помощью макси­мально надежной аналитической системы, не будет иметь смысла, если анализируемые пробы получены в несоответствующее время или при несоответствующем метаболическом состоянии больного. Последнее может иметь важное значение особенно при определе­нии концентрации в крови ренина, альдостерона, СТГ, инсулина или глюкагона. Физическая активность, равно как и стресс, могут значительно изменять исходный уровень в крови пролактина, АКТГ, кортизола, ренина, альдостерона или СТГ. Наконец, син­тез и секреция гормонов могут изменяться под влиянием разнооб­разных лекарственных средств. Такие вещества, как резерпин, альдомет и фенотиазины, повышают содержание пролактина в кро­ви и, больше того, могут вызывать клинически значимую галакто­рею. Диуретики обычно увеличивают исходное содержание ренина в крови. В связи с этим важно предусматривать не только конт­роль за качеством системы определения, но и за условиями, в кото­рых отбирают биологические пробы. Без оптимизации того и дру­гого результаты определений окажутся бессмысленными.

источник