Биотрансформация получение стероидов и гормонов

Биотрансформации стероидных гормонов

Способность клеток микроорганизмов к сложнейшим процессам биотрансформации наиболее полно реализовалась при получении промышленно важных стероидов. Использование абсолютной субстрактной специфичности биологических катализаторов, присущих целым клеткам микроорганизмов, позволило разработать условия осуществления множества химических реакций для структурных перестроек стероидов. В результате были получены новые соединения с лучшими фармакологическими свойствами. Микробиологические трансформации стероидов заключаются в селективном воздействии на одно из положений стероидного скелета. Первый промышленный процесс микробной биотрансформациистероидов основывался на технологии направленного гидроксилирования (11-альфа-гидроксилирование) прогестерона некоторыми видами грибов (Aspergillus ashraceus; рис. 11.1).

Рис. 11.1. Гидроксилирование прогестерона

Значимость другой, разработанной аналогичным методом, микробной трансформации определяется тем, что процессы гидроксилирования кортикостерона лежат в основе промышленного получения следующих ценных продуктов:

1.Противовоспалительных и противоопухолевых препаратов;

Производство ещё одного важного в промышленном масштабе противовоспалительного препарата преднизолона, осуществляется путём микробного гидроксилирования кортизола Arthrobacter simplecs (рис. 11. 2). Необходимо, чтобы среда для осуществления реакции окисления кортизола в преднизолон культурой клеток Arthrobacter simplex включа-ла пептон, глюкозу и кукурузный экстракт.

Правильность преобразования стероидного субстрата контролируют, сочетая химический подход со специфичностью биологической системы. Например, образование уксуснокислого эфира препятствует другим побочным реакциям.

Важнейший источник стероид- ных гормонов – культуры клеток растений. Так, культура клеток диоскореи дельтовиднойкорневого изготовления, продуцирует фитосте-рин диосгенин и его гликозидные производные (сапонины).

Существенно, что способность к сверхсинтезу гликозидов ряда штамммов диоскореи, например штаммма ДМ-ОГ, стабильно поддерживалась в течение 27 лет.

Таким образом, культивирование клеток растений in vitro представляет собой новое решение проблемы промышленного получения вторичных метаболитов.

Дальнейшие успехи в производстве стероидных препаратов связывают с:

1. Применением иммобилизованных клеток;

2.Использованием оптимального сочетания биологических и химических превращений;

3. Совершенствованием технологии очистки получаемых соединений.

Среды для биотрансформации стероидов имеют сложный состав, поэтому к технологии предъявляются требования:

1. Строгого контроля за каждым параметром применяемой среды (рН, время, температура и т. д.);

2.Требуется, чтобы через сутки к смеси добавлялось вещество S Рейхштейна.

3. Необходимо, чтобы процесс осуществлялся в строго нейтральной среде, при температуре 28°С, в течение 120 ч, при оптимальном выходе преднизолона — 93%.

4. Требуется, чтобы крупномасштабное производство преднизолона, путём биотрансформации стероидов, обеспечивало снижение стоимости этого препарата не менее чем в 200 раз.

В проблеме регуляции действия генов у млекопитающих наиболее изучено регулирование проявления действия генов с помощью стероидных гормонов. Общий механизм их действия состоит в активации транскрипции на геномном уровне. Стероидный гормон прикрепляется к молекулам белка рецептора в цитоплазме специфических клеток-мишеней, восприимчивых к стероиду. Образовавшийся в результате этого комплекс стероидного гормона с рецептором мигрирует в ядро, где он прикрепляется к специфическому сайту ДНК в пределах чувствительных к стероиду генов и значительно повышает активность транскрипции этих генов. Исходя из этого, действия стероидного гормона – один из наиболее вероятных путей регуляции проявления генов у трансгенных животных.

Микроорганизмы используются и на отдельных стадиях синтеза лекарственных веществ, который ранее осуществлялся путём многоступенчатых и дорогостоящих химических реакций. Так, один из штаммов хлебной плесени, Rhizopus arrhizus, на начальном этапе синтеза стероида кортизона может гидроксилировать прогестерон. Применение подобной стратегии биоконверсии наряду с традиционными химическими превращениями позволило получать многие стероиды более простыми и дешёвыми способами на основе стеролсодержащего растительного сырья. Именно благодаря этому такие стероиды, как преднизон, дексаметазон, тестостерон и эстрадиол, могут сегодня широко применяться в клинической практике. Некоторое представление об исключительной важности этих веществ в терапии можно получить, ознакомившись с данными таблицы 11.1., где перечислены основные области применения стероидов при заболеваниях.

Таблица 11.1. Области применения стероидов при терапии

Стероид Заболевания
Глюкокортикоиды Кортизон Гидрокортизон Преднизон Преднизолон Дексаметазон Заболевания крови: гемолитическая анемия, острый лейкоз, угнетение костного мозга Аллергии: астма, экзема, анафилаксия Аутоиммунные заболевания: узелковый полиартериит, ревматоидный артрит, височный артериит Прочие: язвенный колит,саркаидоз,нефротический синдром
Половые стероидные гормоны Тестостерон Эстрадиол Прогестерон Гинекологические заболевания: эндометрит, метроррагии, кистозное перерождение яичников, гипофункция яичников, атония матки, ановуляторное состояние фолликулов в яичниках

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Биотехнология стероидных гормонов

Форма проведения лекции:проблемная

План лекции

1. Традиционные источники получения стероидных гормонов.

2. Проблемы трансформации стероидных структур.

3. Преимущества биотрансформации перед химической трансформацией.

1. Несмотря на разнообразие биотрансформаций стероидов, методы проведения микробиологических реакций довольно единообразны. При поисковых работах, где не требуется или нет возможности применять большие количества вещества, ограничиваются проведением реакции в колбах на качалках, загрузка стероида в колбу составляет 100 — 200 мг. Для загрузок порядка 1-2 г стероида применяют стеклянные ферментеры. В промышленности и на опытных установках применяют стальные аппараты, оборудованные аэрирующими и перемешивающими устройствами.

Собранный стеклянный ферментер стерилизуют и загружают стерильной питательной средой с заранее внесенной в нее в асептических условиях трансформирующей культурой. Особое внимание уделяют наблюдению асептики во всех операциях. Стерилизацию в зависимости от объекта осуществляют автоклавированием питательной среды при 110 — 120 0 С в боксах, освещаемых бактерицидными лампами. Операции по загрузке, отбору проб проводят в пламени газовой горелки. Загрузка питательной среды в ферментер, как правило, осуществляется передавливанием стерильным сжатым воздухом. Время роста культуры микроорганизма-трансформатора определяется появлением максимальной трансформирующей активности и может колебаться от нескольких часов для одних культур до нескольких суток для других. Для многих культур-трансформаторов характерна максимальная трансформирующая активность в период снижения удельной скорости роста культуры.

Растворимость стерилов в воде очень низка. В настоящее время стерины, предназначенные для окисления, в небольшой концентрации (порядка 1 г/л) вносят растворенный в малотоксичном, смешивающемся с водой растворителе (ацетоне, спирте, диметилформамиде). При более высоких концентрациях стеринов (выше 1 г/л) их вносят в среду в виде мелкоизмельченной пудры; для этого кристаллы стерина растирают в специальной аппаратуре или разрушают ультразвуком.

Другой способ внесения стеринов для биотрансформации состоит в том, что стерин, например, рептостерин, растворяют в смеси гептан/этиленхлорид, добавляют при перемешивании воду и отгоняют растворитель нагреванием смеси до 95 0 С. При таком методе концентрация ситостерина в водной суспензии может достигать 140 г/л.

Трансформация стеринов микроорганизмами основана на их использовании в качестве источника углерода, поэтому стимуляция роста трансформирующих штаммов должна приводить к увеличению выхода продуктов расщепления стеринов. Процесс стимулируется насыщением среды кислородом. Добавление в питательную среду некоторых масел в количестве 1-3 мас.% (соевого, арахисового, рапсового, оливкового) повышает выход продукта трансформации. Аналогичные результаты получены с применением глицеридов животного и растительного происхождения (тристеарин, триолеин, трипальмитин). Механизм стимуляции роста глицеридами, вероятно, состоит в устранении гидрофобности стеринов, глицериды действуют так же, как истинные ПАВ, обычно применяемых для микробиологических процессов трансформации. Температурный режим микробиологических трансформаций стероидов не отличается от принятых для других микробиологических процессов и составляет 24 33 0 С. Условия рН определяются при отборе штамма культуры-трансформатора и колеблются в широком интервале.

2. Микробиологический контроль осуществляется только на стадии выращивания трансформирующей культуры. Аналитический контроль реакции трансформации ведется путем отбора проб через определенные временные интервалы и анализа их методом тонкослойной хроматографии на силуфоле в присутствии «свидетелей» исходного стероида, целевого продукта трансформации и некоторых промежуточиых и побочных продуктов, если они участвуют в данном процессе.

После завершения трансформации культуральная жидкость, отделенная от мицелия (или другой биомассы), экстрагируется несмешивающимся с водой органическим растворителем, пригодным для растворения соответствуюшего стероида (этилацетат, метиленхлорид или хлороформ). Экстракт, отделенный от водной фазы, проходит требуемую очистку (окрашенные примеси обычно отделяют обработкой с активировинным углем, затем уголь отфильтровывают). Далее его концентрируют в вакууме и полученный осадок стероида перекристаллизовывают из подходящего растворителя. В препаративных целях при работе с небольшими количествами стероидов очистку продукта трансформации можно проводить методом колоничной хроматографии.

3. Специфической особенностью процесса микробиологических трансформаций является использование чистых культур микроорганизмов-трансформаторов. Поэтому необходимым условием технологического режима является соблюдение мер для предотвращения развития посторонней микрофлоры. Последняя постоянно присутствует в воздушных потоках, циркулирующих в производственных помещениях, и представлена в основном мезофильными микроорганизмами, оптимальная температура развития которых находится в пределах 24 — 30 о С. Такой же температурный оптимум характерен, как правило, и для микроорганизмов-трансформаторов.

Все операции по подготовке и выращиванию трансформирующих культур проводят в стерильных условиях с соблюдением правил и норм, разработанных и утвержденных для производста микробного синтеза. Однако внесение стероидного субстрата на трансформацию (в растущую на полноценной питательной среде культур при использовании бактерий или в водную суспензию неразмножающихся клеток в случае применения грибного мицелия) и сам процесс трансформации, как правило, проводят не стерильно. Для уменьшения вероятности загрязнения используют стерильную воду при приготовлении суспензии стероидных субстратов, поскольку сами стероиды обычно неустойчивы в условиях автоклавирования. Одним из вариантов решения этой проблемы может служить способ внесения стероидного субстрата в питательную среду и засева ее трансформирующей культурой в момент, когда температура среды после автоклавирования снизится до 80 о С и безопасна для субстрата. После выдержки в течение 30 мин. среду со стероидом охлаждают до 33 о С и в нее стерильно вносят трансформирующую культуру.

Используют культуру-трансформатор в стадии замедления роста, когда питательные компоненты среды в значительной степени израсходованы, а сильно разросшаяся культура подавляет рост других микроорганизмов. Однако и эти меры не полностью предохраняют трансформационную среду от загрязнения посторонней микрофлорой. В последней могут оказаться виды, способные отрицательно влиять на ход трансформации.

Применяемая в лабораторных условиях стерилизация суспензий стероидов ультразвуком неприемлема для промышленных масштабов.

Контрольные вопросы

1. Какие химические модификации стероидной молекулы осуществляются с помощью биотрансформации?

2. Биотрансформация, особенности процесса.

Биотрансформация стероидных гормонов

Форма проведения лекции:проблемная

План лекции

1. Штаммы микроорганизмов, обладающие способностью к трансформации (биоконверсии) стероидов.

2. Конкретные реакции биоконверсии стероидов. Подходы к решению селективности процессов биоконверсии.

3. Микробиологический синтез гидрокортизона, получение из него путем биоконверсии преднизолона.

1. Специфической особенностью процесса микробиологических трансформаций является использование чистых культур микроорганизмов-трансформаторов. Поэтому необходимым условием технологического режима является соблюдение мер для предотвращения развития посторонней микрофлоры. Последняя постоянно присутствует в воздушных потоках, циркулирующих в производственных помещениях, и представлена в основном мезофильными микроорганизмами, оптимальная температура развития которых находится в пределах 24 — 30 о С. Такой же температурный оптимум характерен, как правило, и для микроорганизмов-трансформаторов.

Все операции по подготовке и выращиванию трансформирующих культур проводят в стерильных условиях с соблюдением правил и норм, разработанных и утвержденных для производста микробного синтеза.

2. Примеры промышленного ислользования микробиологических трансформаций. Получение гидрокортизона (кортизола) из вещества Sосуществляется с помощью С. lіnаtа.

Процесс включает следующие стадии:

1. Выращивание трансформирующей культуры (I стадия) производят путем трех последовательных генераций на питательной среде, содержащей сахарозу, дрожжевой автолизат и сложный набор неорганических солей:

лабораторный инокулят 1 – генерации, инокулят 2-й, инокулят 3-й генерации.

Крышку инокулятора перед засевом обрабатывают водным раствором формалина, аппарат и все помещение облучают бактерицидной лампой и весь процесс выращивания трансформирующей культуры проводят в стерильных условиях. Далее полученная трансформирующая культура поступает в сепаратор, откуда отделенный мицелий в виде водной суспензии передается в ферментер для проведения основной реакции трансформации вещества S.

2. Трансформация вещества (II стадия) также начинается со стерилизации ферментера и воздушного фильтра водным раствором формалина. Особое внимание уделяется размолу стероида на микромельнице и получению суспензии его в стерильной воде с содержанием стероида 1 г/л. Для предотвращения развития посторонней микрофлоры используется добавка антибиотика. Перемешивание и аэрация осуществляются, как и на предыдущей стадии, так же используются и пеногасители.

3. Выделение продукта трансформации — гидрокортизона (ІІІ стадия). Культуральная жидкость вместе с мицелием после ІІ-й стадии поступает на сепарацию. Отделенный мицелий промывается, промывные воды присоединяются к основной культуральной жидкости. Далее производится экстракция-сепарация продукта трансформации из водной среды органическим растворителем. Осветленный активированным углем экстракт подвергается многократному упариванию с различными растворителями, осветлению, снова упариванию досуха и промывке подходящим растворителем. Последние приемы обработки готового технического продукта обычны для технологии получения многих органических веществ и лекарственных препаратов. Получение чистых лекарственных форм гидрокортизона проводится традиционными методами.

Трансформация гидрокортизона в преднизолон:

Выращивание трансформирующей культуры М. globiformeосуществляется такими же последовательными этапами и в тех же аппаратах при тех же условиях аэрации и перемешивания, далее проводится трансформация гидрокортизона с помощью названной дегидрирующей культуры. Выделение готового продукта, преднизолона, осуществляется также путем экстракции-сепарации из культуральной жидкости, отличаясь лишь набором растворителей.

В настоящее время интенсивно разрабатываются методы использования мелкокристаллических стероидных субстратов. Микронизация субстрата до размеров частиц в несколько микрометров и внесение в ферментационную среду без растворителя позволяет повысить исходную концентрацию стероидного субстрата до 20 — 50 г/л.

Описан процесс, получивший название псевдокристаллферментации: дегидрирование измельченного порошка кортизона с помощью культуры Аgrоbасtеr sіtlіехв течение 5 дней. Получен кристаллический преднизолон с выходом 93%. Загрузку стероидного субстрата удается при этом довести до 500 г/л. Дегидрирование микрокристаллического гидрокортизона происходит по схеме:

гидрокортизон (кристаллы) — гидрокортизон (раствор) — преднизолон (раствор) -преднизолон (кристаллы)

В ходе реакции кристаллический гидрокортизон переходит в растворенное состояние и трансформируется внутри клеток в преднизолон, который, накапливаясь, кристаллизуется в виде игл. Отмечено также постоянное остаточное количество гидрокортизона при проведении «псевдокристаллферментации». Предполагают образование при этом «смешанных» кристаллов, состоящих из молекул гидрокортизона и преднизолона, соединенных в определенном соотношении (8:92) в осадок. Однако этот процесс до настоящого времени не получил широкого практического применения.

Одним из путей интенсификации процессов трансформации является предварительное индуцирование растущей культуры — трансформатора соответствующим субстратом или его аналогом. Этот прием связан с индуцированием биосинтеза соответствующих ферментных систем культуры и особенно широко применяется в процессах микробиологической дегидрогенизации.

Наиболее перспективным считается применение закрепленных (иммобилизованных) живых клеток микроорганизмов. Преимущества использования иммобилизованных клеток в технологии очевидно:

1. отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;

2. более высокая активность и стабильность по сравнению с иммобилизованными ферментами и свободными клетками;

3. уменьшение затрат на выделение и очистку продуктов реакции, ввил\ду их изолированности от биомассы и некоторых продуктов обмена;

4. появление возможности создания непрерывных автоматизированных процессов;

5. способность к длительному функционированию полиферментных систем и регенерации кофакторов.

Методы иммобилизации клеток:

2. ковалентное и поперечное связывание;

3. метод включения в различные полимеры;

Метод включения, в частности, в целлюлозные волокна мембраны весьма технологичен и является перспективным для проведения одностадийных процессов. Одним из наиболее экономичных носителей для иммобилизации клеток является капля-каррагинан, полисахарид изприменяемых как пищевая добавкаморских красных водорослей Rоdорусеае, Gіnаtrіnасeаe. Интектные клетки, введенные в гель, интенсивно размножаются на питательной среде и могуг многократно использоваться как полиферментные системы.

Включение в альгинатные гели относится к мягким методам иммобилизации, т.е. клетки после иммобилизации остаются жизнеспособными и могут осуществлять полиферментные процессы. Положительными качествами геля являются возможность размножения в нем клеток, а также его способность к растворению при изменении рН и температуры, что позволяет выделять жизнеспособные клетки и облегчает изучение их физиологии и морфологии. Во многих случаях включение клеток в альминат приводит к лучшим результатам по сравнению с карратизаном. Преимущества иммобилизованных клеток делают их весьма перспективными. В частности, трансформации стероидных соединений. Именно стероиды были одними из первых субстратов, которые удалось трансформировать с помощью иммобилизованных клеток. В настоящее время достаточно досконально изучены процессы трансформации стероидных соединений живыми иммобилизованными клетками, исследованы пути направленного изменения ферментативной активности и ее стабилизации.

Контрольные вопросы

3. Какие химические модификации стероидной молекулы осуществляются с помощью биотрансформации?

4. Что служит основным источником сырья для производства стероидных препаратов и почему?

5. На чем основан выбор микроорганизмов, способных трансформировать стероиды?

Последнее изменение этой страницы: 2016-09-18; Нарушение авторского права страницы

источник

Биотехнология в животноводстве

Способность клеток микроорганизмов к сложнейшим процессам биотрансформации наиболее полно реализовалась при получении промышленно важных стероидов. Использование абсолютной субстрактной специфичности биологических катализаторов, присущих целым клеткам микроорганизмов, позволило разработать условия осуществления множества химических реакций для структурных перестроек стероидов. В результате были получены новые соединения с лучшими фармакологическими свойствами. Микробиологические трансформации стероидов заключаются в селективном воздействии на одно из положений стероидного скелета. Первый промышленный процесс микробной биотрансформации стероидов основывался на технологии направленного гидроксилирования (11-альфа-гидроксилирование) прогестерона некоторыми видами грибов (Aspergillus ashraceus; рис. 11.1).

Рис. 11. 2. Гидроксилирование кортизола

Значимость другой, разработанной аналогичным методом микробной трансформации, определяется тем, что процессы гидроксилирования кортикостерона лежат в основе промышленного получения следующих ценных продуктов:
1.Противовоспалительных и противоопухолевых препаратов;
2. Транквилизаторов;
3. Анестезирующих средств;
4. Половых гормонов.
Производство ещё одного важного в промышленном масштабе противовоспалительного препарата преднизолона, осуществляется путём микробного гидроксилирования кортизола Arthrobacter simplex (рис. 11. 2).
Необходимо, чтобы среда для осуществления реакции окисления кортизола в преднизолон культурой клеток Arthrobacter simplex включала пептон, глюкозу и кукурузный экстракт.
Правильность преобразования стероидного субстрата контролируют, сочетая химический подход со специфичностью биологической системы. Например, образование уксуснокислого эфира препятствует другим побочным реакциям.
Важнейший источник стероидных гормонов – культуры клеток растений. Так, культура клеток диоскореи дельтовидной корневого изготовления, продуцирует фитостерин диосгенин и его гликозидные производные (сапонины).
Существенно, что способность к сверхсинтезу гликозидов ряда штамммов диоскореи, например штаммма ДМ-ОГ, стабильно поддерживалась в течение 27 лет.
Таким образом, культивирование клеток растений in vitro представляет собой новое решение проблемы промышленного получения вторичных метаболитов.
Дальнейшие успехи в производстве стероидных препаратов связывают с:
1. Применением иммобилизованных клеток;
2.Использованием оптимального сочетания биологических и химических превращений;
3. Совершенствованием технологии очистки получаемых соединений.
Среды для биотрансформации стероидов имеют сложный состав, поэтому к технологии предъявляются требования:
1. Строгого контроля за каждым параметром применяемой среды (рН, время, температура и т. д.);
2.Требуется, чтобы через сутки к смеси добавлялось вещество S Рейхштейна.
3. Необходимо, чтобы процесс осуществлялся в строго нейтральной среде, при температуре 28 ° С, в течение 120 ч, при оптимальном выходе преднизолона — 93%.
4. Требуется, чтобы крупномасштабное производство преднизолона, путём биотрансформации стероидов, обеспечивало снижение стоимости этого препарата не менее чем в 200 раз.
В проблеме регуляции действия генов у млекопитающих наиболее изучено регулирование проявления действия генов с помощью стероидных гормонов. Общий механизм их действия состоит в активации транскрипции на геномном уровне. Стероидный гормон прикрепляется к молекулам белка рецептора в цитоплазме специфических клеток-мишеней, восприимчивых к стероиду. Образовавшийся в результате этого комплекс стероидного гормона с рецептором мигрирует в ядро, где он прикрепляется к специфическому сайту ДНК в пределах чувствительных к стероиду генов и значительно повышает активность транскрипции этих генов. Исходя из этого, действия стероидного гормона – один из наиболее вероятных путей регуляции проявления генов у трансгенных животных.
Микроорганизмы используются и на отдельных стадиях синтеза лекарственных веществ, который ранее осуществлялся путём многоступенчатых и дорогостоящих химических реакций. Так, один из штаммов хлебной плесени, Rhizopus arrhizus, на начальном этапе синтеза стероида кортизона может гидроксилировать прогестерон. Применение подобной стратегии биоконверсии наряду с традиционными химическими превращениями позволило получать многие стероиды более простыми и дешёвыми способами на основе стеролсодержащего растительного сырья. Именно благодаря этому такие стероиды, как преднизон, дексаметазон, тестостерон и эстрадиол, могут сегодня широко применяться в клинической практике. Некоторое представление об исключительной важности этих веществ в терапии можно получить, ознакомившись с данными таблицы 11.1., где перечислены основные области применения стероидов при заболеваниях.

источник

Биотехнология стероидных гормонов. Традиционные источники получения стероидных гормонов. Проблемы трансформации стероидных структур

Стероидные гормоны являются производными стеролов, синтезируются в надпочечниках, семенниках, яичниках и некоторых других органах и тканях (печень, плацента). К стероидным гормонам относятся кортикостерон, кортизол, альдостерон, прогестерон, эстрадиол, эстриол, тестостерон, а также стерол витамина Д-кальцитриол.

Биосинтез стероидных гормонов

Существует два пути биосинтеза стероидных гормонов. Первый путь состоит в превращении холестерола в стероидные гормоны путём окисления его в прогестерон и, далее, в другие производные последнего. Этот путь реализуется в надпочечных железах под влиянием адренокортикотропного гормона. Второй путь заключается в биосинтезе гормонов из ацетил-КоА, минуя холестерол. Промежуточным продуктом биосинтеза является прогестерон.

Стероиды– производные полициклических спиртов – стеролов, у которых укорочена (окислена) боковая цепь (20-27атомы). Из биологических объектов выделено несколько десятков стероидов. Но только примерно двадцати из них свойственна гормональная функция. Так, в короковом веществе надпочечников продуцируется более 40 различных стероидов, которым присвоено общее название – кортикостероиды. Восемь из них являются гормонами. Наибольшее распространение и значение в организме имеют кортикостерон, 17-оксикортикостерон (кортизол) и альдостерон (в сумме они составляют 4/5 всех кортикостероидов коры надпочечников).

Кортикостерон– кристаллическое соединение с tпл.=220°С. Растворы препарата оптически активны. В течение суток в надпочечниках синтезируется от 4,9 до 7,9мг кортизола. В норме, содержание кортизола в периферической крови человека составляет 110мкг/л.

Альдостерон– кристаллическое вещество с tпл.=219°С. Растворы препарата оптически активны. В надпочечниках за сутки образуется 0,15-0,4мг альдостерона. На его долю приходится всего 1-2% от суммы кортикостероидов. При недостаточности альдостерона развивается бронзовая болезнь, характеризующаяся резким нарушением минерального обмена.

Тестостерон– кристаллы с tпл.=155°С. Оптически активен. Содержание у человека составляет 21,6мкг/л (сырой ткани).

Эстрадиолкристаллизуется в двух модификациях: в виде перистых листочков с tпл.=175-177°С и в форме призматических игл с tпл.=178,5-179,5°С. Вырабатывается в яичниках в количестве 1мг в сутки. При недостаточности эстрадиола у женщин нарушаются циклы менструации, происходят самопроизвольные выкидыши, развивается ожирение. Эстрадиол оказывает влияние на обмен углеводов, белков и нуклеиновых кислот.

Внедрение биотрансформации в процессы получения стероид­ных гормональных препаратов вызвало буквально переворот в фармацевтической промышленности, позволив многократно уде­шевить и сделать эти ценные лекарственные препараты доступ­ными для большинства нужд Для синтеза указанных гормонов используют природные со­единения, содержащие стероидную структуру, которую необхо­димо химически модифицировать перед введением функциональ­ных заместителей того или иного гормона.

В качестве исходного сырья для производства этих препаратов используются стерины растений (класс фитостеринов). Прежде всего, это — эргостерин, обнаруженный у многочисленных пред­ставителей растительного мира, а также у грибов и микроорга­низмов.

Особенно много эргостерина в дрожжевых микроорганизмах (для его промышленного получения используют пекарские дрож­жи).

Следующий представитель фитостеринов — стигмастерин, ко­торый в значительных количествах присутствует в соевом масле и сахарном тростнике. Весьма близок к нему по структуре (i-сито-стерин, отличаясь лишь отсутствием двойной связи в боковой цепи .

Ситостерины присутствуют в больших количествах в хлопко­вом масле, в зародышах пшеницы, в натуральном каучуке, в са­харном тростнике. Получают ситостерин и при переработке дре­весины в целлюлозно-бумажном производстве.

В условиях промышленного производства из ситостерина полу­чают андростендион (АД) путем окисления боковой цепи стерина с образованием 17-кетоандростана с помощью мутантных штам­мов Mycobacterium vacca (штаммы, у которых блокированы систе­мы, ответственные за полный распад стероидного скелета). В этой комплексной технологии помимо химических стадий использу­ются методы микробиологической трансформации для введения гидроксильной группы в 1,1-положение стероидной структуры и двойной связи в 1,2-положение. Для этих групп известны альтер­нативные химические варианты, но они уступают по эффектив­ности биотрансформации из-за многостадийности, более низко­го выхода и по экологическим показателям. О высокой региосе-лективности микробиологического отщепления боковой цепи си­тостерина (без затрагивания стероидного скелета) свидетельству­ет высокий выход (70 — 80%) продукта трансформации.

Кроме выхода целевого продукта важным показателем, опре­деляющим экономичность процесса микробиологической транс­формации стероидного субстрата, является концентрация стеро­ида в культуральной жидкости. В данном процессе концентрация ситостерина составляет 10—15 г/л, при этом стерин вносится в культуральную жидкость в микронизированном виде. Поскольку стероиды трудно растворимы в воде, то и целевой продукт транс­формации — АД на 99 % выделяется в виде кристаллов.

Это свойство стероида определяет метод его извлечения. Сна­чала методом фильтрации культуральную жидкость отделяют от биомассы и кристаллов АД. Затем последние растворяют в ацето­не и еще раз фильтруют для отделения от биомассы. Концентрированием ацетонового раствора выделяют АД, который на конеч­ной стадии перекристаллизовывают. Аналитический контроль ре­акции трансформации ведут отбором проб через определенные временные интервалы и анализом их методом тонкослойной хро­матографии на силуфоле в присутствии «свидетелей» — исходно­го стероида, целевого продукта трансформации и некоторых про­межуточных и побочных продуктов, которые участвуют в данном процессе. Дальнейшей химической модификацией АД получают такие препараты, как тестостерон, метилтестостерон, оксипрогестерона капронат, спиронолактон и др.

Биотрансформация стероидов — аэробный процесс глубинной ферментации, для проведения которой используется оборудова­ние, отвечающее высокой степени массообмена. Трансформация может осуществляться как растущей на среде культурой, так и отмытыми от питательной среды клетками микроорганизма. По­следний вариант предпочтительнее, поскольку облегчает выделе­ние и очистку целевого продукта. Но, как показала производствен­ная практика, не все микроорганизмы переносят промышленное сепарирование без потери активности; так, представители мукоровых грибов очень чувствительны к сепарированию, тогда как представители несовершенных грибов теряют свою активность незначительно.

Способность трансформировать стероиды обнаружена в самых разных группах микроорганизмов. Используются, как правило, естественные штаммы, выделенные из почвы или из других объек­тов. Условно можно сказать, что процессы гидроксилирования наиболее распространены среди грибов. Так, процесс гидроксилирования способны осуществлять представители 300 видов микроорганизмов, причем 50 % из них — несовершенные грибы и 20 % — фикомицеты. Бактериальным культурам больше присущи процессы окисления гидроксильных групп до кетонов, восстанов­ление кетонов до оксигрупп, введение в кольцо стероидной мо­лекулы двойных связей.

Наиболее известные lα-гидроксилирующие культуры отно­сятся к родам Absidia, Beanveria, Curvularia, Cunninghamella. Для дегидрирования в положении 1,2 в основном применяют Согупе-bacterium simplex. Для изомеризации с одновременным окислени­ем 3-оксигруппы в 3-кетогруппу широко используются штаммы Corynebacterium mediolanum (sin. Flavobacterium dehydrogenans). Отметим важность этой реакции, поскольку источники сырья (диосгенин, соласодин) содержат 3-оксигруппу, тогда как актив­ные стероидные препараты должны иметь 3-кетогруппу.

Специфическая особенность процесса биотрансформаций — использование чистых культур микроорганизмов. Поэтому все опе­рации по подготовке и выращиванию трансформирующих куль­тур проводят в стерильных условиях. Используют культуру-трансформатор в стадии замедления роста, когда питательные компоненты среды в значительной степени израсходованы, а силь­но разросшаяся культура подавляет рост посторонней микрофло­ры. Что касается микробиологического контроля, то он осуще­ствляется только на стадии выращивания трансформирующей культуры.

Стероиды — малорастворимые в воде соединения: их раство­римость колеблется от 0,3 г/л (гидрокортизон) до 0,01 г/л (ацетонид фторкортексолона). Важным аспектом эффективности про­цессов трансформации является выбор оптимальной концентра­ции субстрата, зависящий от биологической доступности послед­него. Поэтому трансформационные процессы осуществляют обычно при концентрации субстрата в пределах 1 — 10 г/л, что предпола­гает нахождение основной массы стероида в твердой фазе. В этом случае необходимым условием является высокая степень предва­рительного измельчения стероидного субстрата (поступает в сре­ду в микронизированном виде) с использованием ультразвуко­вых или механических измельчителей. В случае, когда растворимость стероидного субстрата слишком мала для проявления присущей микроорганизму ферментативной активности, задействуют методы, повышающие водорастворимость стероидов.

Первый — подача стероида в растворителе, смешивающемся с водой (ацетоне, метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и др.). Ограничением для применения этого ме­тода является токсичность определенных концентраций раство­рителей.

Второй — использование водорастворимых форм стероидов в виде натриевых солей 2,1-гемисукцинатов или фосфатов. Ослож­няющим моментом для широкого использования таких модифи­каций является высокая степень избирательности по отношению к ним со стороны микроорганизмов, например для дегидриру­ющего микроорганизма Corynebacterium simplex эти формы стеро­идов оказались недоступны.

Третий метод — заключение стероидов в растворимый комп­лекс с циклодекстрином. Использование комплекса стероидов с циклодекстрином не имеет ограничений предыдущих методов.

Микробиологическое гидроксилирование — наиболее часто применяемый метод получения стероидных препаратов, так как присутствие гидроксильных групп в 3,11,16,17-положениях моле­кулы стероида обусловливает, как правило, физиологическую ак­тивность для большинства гормональных стероидных препаратов.

Дата добавления: 2018-04-04 ; просмотров: 3114 ; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ

источник